摘要:细菌是海区生态环境的重要组成部分,为了解扇贝养殖海区细菌群落结构的季节性变化,连续11个月(2009年5月—2010年4月,2月除外)定期采集青岛流清河湾扇贝养殖海区水深0.5 m处水样,过滤收集粒径0.22~3.00 μm的微生物,采用CTAB法提取样品总DNA,PCR扩增细菌16S rDNA V3-V5可变区序列,并通过DGGE技术对所得序列进行分离,结果共得到36条不同位置的条带,1月份水样细菌群落条带数最为丰富,3月份水样的细菌群落条带数最少。基于各月份DGGE条带数目和相对光密度,对11个月份样品的细菌群落多样性进行UPGMA聚类分析,结果表明,3、4和5月份细菌群落多样性具有较高的相似性,优先聚为一支,其余月份中,7月和8月,9月和12月,10月和11月分别优先聚为一支,而1月份和6月份均单独分为一支。剪切DGGE图谱中的20条主要谱带重扩增、测序,并进行BLAST比对。结果表明,20条序列与已知序列的相似性均在94%以上,这20条序列所代表的细菌分属于α-变形菌亚门(α-Proteobacteria)、β-变形菌亚门(β-Proteobacteria)、γ-变形菌亚门(γ-Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。

摘要:为了研究牡蛎养殖过程中副溶血弧菌与水质因子之间的关系,2009年3月到11月从广东阳西某牡蛎养殖场采集牡蛎样品检测其副溶血弧菌的感染情况,并检测水体温度、盐度、pH和溶解氧。实验结果表明:副溶血弧菌总量的检出率为94.38%。水温和副溶血弧菌总量呈正相关,盐度和副溶血弧菌总量呈负相关,pH和溶解氧与副溶血弧菌总量的相关性不明显。对水温和盐度与副溶血弧菌总量的对数进行回归分析,水温和副溶血弧菌浓度的拟合回归方程为LgVP=0.093T-0.685(R²=0.336);盐度和副溶血弧菌浓度的拟合回归方程为LgVP=1.199+0.116S-0.004S²(R²=0.217);水温和盐度对副溶血弧菌浓度的拟合回归方程为LgVP=-1.941+0.116T+0.058S-0.001S²(R²=0.414)。研究结果可为牡蛎养殖过程中副溶血弧菌的风险分析提供参考依据。

摘要:白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)作为炎症反应的关键介导物,通过开启基因的表达来调控免疫反应。为了丰富鱼类该基因的研究,实验采用RT-PCR和RACE-PCR技术,首次从鲇形目鱼类大鳍鳠中获得IL-1β基因cDNA的全序列。大鳍鳠IL-1β基因cDNA全长1 194 bp,包括3′非编码区域(UTR)为224 bp,5′UTR为82 bp,开放阅读框(ORF)为888 bp,编码296个氨基酸。预测的蛋白质分子量为33.843 43 ku,等电点为5.00。与斑点叉尾〖XCF5H.TIF〗等其他8种脊椎动物进行同源性分析发现,大鳍鳠IL-1β氨基酸序列与斑点叉尾〖XCF5H.TIF〗相似性最高,为79.0%,与原鸡的相似性最低,为22.0%。进化树分析表明,大鳍鳠IL-1β与斑点叉尾〖XCF5H.TIF〗聚为一支。半定量PCR显示,大鳍鳠IL-1β基因在肌肉、脑、脾脏、头肾、体肾、胃、皮肤、肝脏及肠等组织中都有不同程度的表达;经嗜水气单胞菌刺激后大鳍鳠IL-1β基因在头肾和脾脏的转录表达显示,1 d后该基因在头肾与脾脏中的表达量都达到最大,15 d后恢复到刺激前的水平。研究显示,大鳍鳠IL-1β在抵御病原感染过程中发挥重要作用。

摘要:以0.4 mg/kg的给药剂量进行口灌和肌肉注射给药,研究伊维菌素(IVM)在鲫体内的药代动力学。两种给药方式下,鲫组织中的IVM药—时曲线大都呈现多峰现象。肌肉注射给药后,药动学统计矩参数为C_max=0.445 mg/L、T_max=48 h、t_1/2z=524.2 h、MRT_{(0-∞ )}=788 h、AUC_{(0-∞ )}=289.2(mg/L)·h;口灌给药后,药动学统计矩参数为i>C_max=0.264 mg/L、T_max=8 h、t_1/2z=153.9 h、MRT_{(0-∞ )}=269.78 h、AUC_{(0-∞ )}=83.77(mg/L)·h。两种给药方式相比,口灌组鲫对药物的吸收和清除均较快,而肌肉注射组鲫各组织中的药物浓度高,AUC值也较大。两种给药方式下,IVM在鲫各组织中AUC_(0-600)值呈现相同的排列顺序,由大到小分别为性腺、血液、肾脏、肝胰脏、肌肉。IVM在鲫性腺和肾脏中均具有一定的蓄积作用,其主要表现为药物浓度高,MRT值大,且清除率低于血药的清除率,其中卵巢的积蓄作用最为明显。25 ℃的水温条件下，肌肉注射给药后，鲫休药期应不低于25 d;口灌给药后,鲫的休药期应不低于15 d。休药期与水温条件和给药剂量有关,因此在养殖生产过程中的休药期要根据实际情况适当调整。

摘要:钠/葡萄糖共转运载体1(sodium/glucose cotransporter 1,Sglt1)是协助葡萄糖吸收的主要蛋白。实验首先采用RT-PCR获取sglt1基因全长,克隆至PGME-T载体进行序列及免疫原性分析,选择长度为92个氨基酸(544~637)的多肽作为目的片段(sglt1-P),扩增sglt1-P,引入双酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ后,连接至pET-32a(+)上,构建表达载体pET-32a(+)-sglt1-P,转化至E.coli Rosetta中,获得重组基因工程菌,通过IPTG诱导表达,获得目标多肽,并以此为抗原制备Sglt1特异性抗体。SDS-PAGE电泳分析表明,目标多肽分子量约为30 ku。采用耳缘静脉结合皮下注射,免疫新西兰长耳兔,免疫总时长为38 d。制备了鲤Sglt1抗体,ELISA测得效价为1:10⁵;免疫组化结果表明,抗体具有较高亲和力和特异性,可以应用于鲤Sglt1的表达定位研究。该抗体的获得为鲤肠道Sglt1表达及转运活性的系统研究奠定了基础,同时,获取的Sglt1抗体亦可用于其它鱼类Sglt1转运蛋白表达定位和定量研究。

摘要:为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体 pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni²⁺柱纯化后的重组蛋白,以每尾500 μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫注射第21天人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。

摘要:为探讨锦鲤的抗逆机理,在实验室条件下研究了持续热应激对大正三色锦鲤非特异性免疫指标及HSP70基因相对表达量的影响。分别于应激前、应激后2、6、10、14、18、22、26 h进行取样测定呼吸爆发、补体蛋白3(C3)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及热休克蛋白70(HSP70)基因的相对表达量。结果发现,热应激后呼吸爆发降低,在应激后2、10、18～26 h降低显著(P<0.05);热应激2 h后血清中C3含量略有上升,应激6～26 h过程中与应激前相比均下降,应激14～22 h显著地下降(P<0.05);热应激下血清中SOD有上升的趋势,但差异不显著(P>0.05);热应激下,血清中MDA浓度升高,应激10～18 h上升显著(P<0.05);应激后2、26 h HSP70基因的相对表达量与应激前相比显著性地上升了5.93倍、2倍(P<0.05),应激后6～22 h HSP70基因的相对表达量与应激前水平无显著性差异(P>0.05)。结果表明,热应激影响锦鲤非特性免疫指标,降低锦鲤非特异性免疫力;HSP70的表达受热应激调节,热应激下诱导合成的HSP70对锦鲤起到一定的应激保护作用。

摘要:探讨了以植物生物反应器开发利用抗菌肽类物质防治水产动物病害的效果和机理。以携带中国明对虾抗菌肽—对虾素3-2的转基因水稻米糠制作罗非鱼饲料,研究其对饲料腐败和吉富罗非鱼嗜水气单胞菌肠炎的抑制效果。通过测定米糠和饲料中的霉菌总数、细菌总数,发现水稻中表达的对虾素3-2能有效抑制饲料中的霉菌与细菌的繁殖,对于保持饲料品质具有显著的效果。选取规格一致、体质健壮的吉富罗非鱼,随机分成5组,每组3个重复,分别投喂含20%非转基因米糠的饲料与含不同质量比(10%、20%、30%)的转基因米糠的饲料。通过嗜水气单胞菌攻毒保护实验,结果发现,转基因米糠对罗非鱼嗜水气单胞菌肠炎具有显著的保护效果。对吉富罗非鱼的肠道主要微生物数量、中肠石蜡切片的进一步分析发现,摄食转基因米糠饲料组的罗非鱼肠道内大肠杆菌比例降低,乳酸菌比例提高,肠道微绒毛的结构完整性显著改善。由此推断抗菌肽转基因水稻的防病效果可能与肠道微生物的改变和对肠道结构的保护作用有关。但是石蜡切片发现过量添加转基因米糠(30%)也会导致吉富罗非鱼肠道上皮细胞损伤。

摘要:利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列［其结构特征为正链(19 nt)-环(4 nt)-负链(19 nt)］。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTR^TM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA-124、pshRNA-896和pshRNA-NNV。然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-time RT-PCR检测CP基因mRNA的表达水平变化。结果表明,在pEGFP-CP与shRNA干扰载体共转染组,pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV的荧光抑制效率分别为47%、68%、51%。 3种shRNA干扰载体都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中pshRNA-896干扰效率最好。Real-time RT-PCR检测表明,干扰质粒pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV对pEGFP-CP基因的沉默效率分别约为60%、96%和55%,与对照组相比差异显著(P<0.05)。研究表明,靶向斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因的shRNA干扰载体构建成功,为进一步运用RNA干扰技术进行CP基因的功能研究奠定了基础。

摘要:以凡纳滨对虾为研究对象,在基础饲料中分别添加从健康对虾消化道中分离纯化的优势菌菌株——美人鱼发光杆菌PC463和坚强芽孢杆菌PC465(菌含量≥10¹¹ CFU/g)的活菌和破碎菌各1 g/kg,观察其对凡纳滨对虾血淋巴免疫酶活性和抗WSSV感染保护率的影响。经过20 d养殖实验后发现,与对照组相比,饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫实验,其凡纳滨对虾血淋巴中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性在不同程度上有所提高,并显著高于对照组(P<0.05)。WSSV感染后饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌的免疫组存活率(53%?12%)和添加美人鱼发光杆菌灭活菌的免疫组存活率(49%?15%)显著高于对照组(P<0.05)。结果表明:饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌和美人鱼发光杆菌灭活菌可以在一定程度上提高凡纳滨对虾免疫酶活性和抗WSSV感染能力,上述有防病作用的益生菌株以饲料添加剂的方式应用于对虾养殖生产,可望成为对虾白斑病生物防治的有效途径之一。

摘要:以Primer p14(5′-GATCAAGTCC-3′)为引物对分离自患病斑点叉尾鮰海豚链球菌强毒株DGX07进行RAPD分析。同时参照GenBank中海豚链球菌simA基因序列设计特异性引物,以DGX07基因组DNA为模板,扩增出约1 500 bp的simA基因,并将其克隆到pMD19-T 载体上,之后对重组质粒进行PCR和双酶切(BamHⅠ+XhoⅠ)鉴定,鉴定正确后送测序公司测序。RAPD分析结果显示,DGX07和标准菌株均能扩增出750 bp大小的条带。通过生物信息学软件对测序结果分析显示,simA基因全长1 566 bp,由521个氨基酸组成,与海豚链球菌simA和simB亲缘性达100%,存在1个由41个氨基酸组成的信号肽,具有Bap31和Gram_pos_anchor两个超家族的保守结构域;具有与蛋白翻译后修饰功能相关的磷酸化位点22个和N-糖基化位点2个,编码多肽链中亲水区大于疏水区,是一种膜外蛋白,并具有多个抗原优势位点区域。密码子偏爱性分析表明,斑点叉尾鮰源海豚链球菌simA基因密码子使用频率差异较大,密码子偏爱性与酵母较为接近。获得GenBank登录号为JF330100。

摘要:利用生物化学方法和电镜技术,研究人工注射免疫多糖及WSSV对红螯光壳螯虾幼虾肝胰腺POD、LSZ、SOD、PO的活性变化及肝胰腺超微结构的影响。试验分对照组、实验组Ⅰ(注射WSSV)、实验组Ⅱ(注射免疫多糖)、实验组Ⅲ(注射免疫多糖48 h后注射WSSV)4组,结果显示,随着处理时间的增加,实验组Ⅰ与对照组相比POD、PO、LSZ活性均呈现明显降低趋势(P<0.01),而SOD活性呈现先升高后降低的趋势(P<0.01);实验组Ⅱ的螯虾4种酶活性呈现先升后降,与对照组相比酶活性增加(P<0.05);实验组Ⅲ 4种酶活性均高于实验组Ⅰ(P<0.05),但与对照组相比SOD、POD、LSZ活性降低(P<0.01)。红螯光壳螯虾幼虾肝胰腺组织由肝小管组成,肝小管由基膜和上皮细胞组成。超微结构显示,对照组螯虾幼虾肝胰腺单层柱状上皮细胞的表面微绒毛排列整齐,各细胞器结构完整;实验组Ⅰ上皮细胞微绒毛受损、断裂,核膜解体,细胞核破裂,粗面内质网断裂;实验组Ⅱ上皮细胞粗面内质网核糖体增多;实验组Ⅲ与实验组Ⅰ相比,细胞核结构完整,粗面内质网肿胀,线粒体部分畸变。结果说明感染WSSV的幼虾肝胰腺形态结构受损,并进一步影响其生物学功能。人工注射免疫多糖能提高幼虾免疫相关酶活性,在一定程度上能抵抗WSSV的侵染。

摘要:从草鱼肠道中分离到1株细菌,通过形态学观察、生理生化特征和16S rDNA序列分析等鉴定为弗氏柠檬酸杆菌,动物试验结果表明,该菌对斑马鱼有致病性;从感染诱导的斑马鱼皮肤组织中提取总RNA,经Biotin荧光标记与拥有15 617个cDNA片段的斑马鱼基因芯片(affymetrix)杂交筛选分析,获得斑马鱼皮肤免疫相关差异表达基因88个,其中有74个上调表达基因和14个下调表达基因;进一步根据基因功能聚类(GO)分析,初步将88个差异表达基因分为8个生物学功能,其中主要参与补体激活、急性期反应、应激防御反应、细胞凋亡、抗原加工提呈、细胞迁移粘附、凝血因子和血小板激活等免疫应答过程;同时进行信号通路(pathway)分析,结果表明MAPK(hsp70、daxx、nfkbiab)、JAK/STAT(ifn1)和TGFβ(thbs1)等信号通路参与斑马鱼皮肤抗弗氏柠檬酸杆菌感染免疫应答。采用基因芯片方法筛选与鱼类皮肤免疫相关的功能基因,为将来以斑马鱼为模型研究鱼类皮肤局部免疫应答的分子机制提供科学依据。

摘要:以初始体质量为(33.52?0.17) g建鲤为研究对象,在室内单循环养殖系统中进行8周(w)生长试验,分别配制成添加0.0%(对照)和0.5%(试验)丙氨酰—谷氨酰胺(Ala-Gln)的等氮等能(35% CP、17 kJ/g)饲料,采用5种投喂方式:连续8 w投喂对照饲料(Ⅰ);试验饲料2 w间隔投喂(Ⅱ);前4 w投喂试验饲料,后4 w投喂对照饲料的间隔投喂(Ⅲ);前4 w投喂对照饲料,后4 w投喂试验饲料的间隔投喂(Ⅳ);8 w连续投喂试验饲料(Ⅴ)。养殖试验结束时,进行急性拥挤胁迫试验。探讨Ala-Gln投喂方式对建鲤生长和抗急性拥挤胁迫能力的影响。结果表明,Ala-Gln连续投喂和间隔投喂组的生长都显著高于对照组(P<0.05)。2 w间隔投喂的特定生长率都显著高于4 w间隔和连续8 w投喂的饲料组(P<0.05);前4 w间隔投喂组的特定生长率要显著高于8 w连续投喂组(P<0.05)。血清皮质醇和血糖分别在急性胁迫后恢复0和1 h时达到高峰,血清HSP70在胁迫后恢复1~12 h都保持较高水平,然后下降,胁迫后恢复48 h达到胁迫前的水平。各种投喂方式组的血糖和血清皮质醇含量都显著低于对照组(P<0.05)。胁迫后恢复期,血糖迅速升高幅度最小的是2 w间隔投喂组,最先恢复到胁迫前状态的是2 w间隔投喂组和前4 w投喂的4 w间隔投喂组。胁迫后恢复期,各投喂组的血清HSP70都显著高于对照组(P<0.05),胁迫后恢复48和72 h时,后4 w投喂的4 w间隔投喂组和连续8 w的投喂组的血清HSP70显著高于对照组(P<0.05)。

摘要:以鱼粉和玉米蛋白粉作蛋白源,配制6种等氮等能的饲料。其中5种饲料(C0、C12、C25、C38和C50.5)分别含有0%、12%、25%、38%和50.5%的玉米蛋白粉以替代相应的鱼粉蛋白。其余1种饲料(C50.5_CAA)是在饲料C50.5基础上补充1.8%晶体氨基酸混合物(L-lysine:1.2%,L-arg:0.6%)。经7周的生长试验,结果表明随着饲料中玉米蛋白粉替代水平的升高,大菱鲆(12.51?0.02) g的摄食率、特定生长率、饲料效率和蛋白质效率均显著下降。饲料中玉米蛋白粉含量为50.5%时,大菱鲆摄食率显著低于其他处理组(P<0.05)。当饲料中玉米蛋白粉含量超过25%时,大菱鲆特定生长率显著低于对照组(C0)(P<0.05)。当饲料中玉米蛋白粉含量超过38%时,饲料效率和蛋白质效率与对照组(C0)相比显著下降(P<0.05)。C50.5_CAA组的摄食率、特定生长率和蛋白质效率与C50.5组相比都有升高的趋势,但差异不显著。而饲料中添加晶体氨基酸显著提高了大菱鲆的饲料效率(P<0.05)。饲料中玉米蛋白粉替代鱼粉对大菱鲆鱼体水分、粗蛋白、粗脂肪及灰分含量均无显著影响。饲料中玉米蛋白粉替代鱼粉对大菱鲆血清甘油三酯和尿素氮含量也不产生显著影响,然而,随着饲料中玉米蛋白粉含量升高,血清总胆固醇含量显著下降(P<0.05)。

摘要:利用RACE 技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD 基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn²⁺结合位点和 2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。

摘要:在等蛋白质、等能量基础上,研究碳水化合物与脂类比例(CHO∶L)为10.75∶1、4.81∶1、2.66∶1、1.52∶1和0.87∶1的5组试验饲料对红螯光壳螯虾［初始体质量(1.72?0.01) g］相关生长、生理、生化指标的影响。8周试验结果表明,CHO∶L比例为2.66∶1时,红螯光壳螯虾的增重率、特定生长率和饲料利用率达到最高。高比例的CHO∶L(10.75∶1)和低比例的CHO∶L (0.87∶1)都会显著地抑制(P<0.05)红螯光壳螯虾的生长和饲料的利用。饲料脂肪水平为40～145 g/kg时,虾的脂肪酶和碱性磷酸酶活力显著升高(P<0.05),己糖激酶和丙酮酸激酶活力则呈显著降低趋势(P<0.05)。CHO∶L对虾胃蛋白酶活力影响显著(P<0.01),CHO∶L为2.66∶1和1.52∶1表现出比较高的活力,显著高于(P<0.05)其它试验组。碳水化合物为156.3~360.4 g/kg范围内,虾淀粉酶活力随饲料中碳水化合物的升高而显著升高(P<0.01)。红螯光壳螯虾增重率分别与饲料中碳水化合物和脂肪水平进行二次回归分析得出,红螯光壳螯虾对配合饲料中碳水化合物和脂肪的最适需求量分别为268.28和120.22 g/kg,相对应的CHO∶L为2.20∶1,且红螯光壳螯虾对碳水化合物的利用能力要高于对脂肪的利用。

摘要:应用抗牙鲆淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus,LCDV)受体蛋白(27.8 ku)的单克隆抗体(2G11和3D9)定位LCDV受体蛋白在牙鲆组织中的分布。通过对牙鲆外周血、白细胞、鳃、胃、肠、表皮、肝脏、头肾、体肾、脾、性腺、脑、心脏等进行LCDV受体蛋白的间接免疫荧光与免疫组织化学定位观察,发现在牙鲆外周血白细胞的细胞膜、鳃上皮细胞、表皮、胃黏膜上皮细胞顶端、肠上皮细胞、肝细胞、脾表层结缔组织细胞及头肾后端的肾小管上皮细胞内均有较强的阳性信号,表明这些部位分布有LCDV的 27.8 ku受体蛋白,但在体肾、性腺、脑、心脏及外周血红细胞中未观察到阳性信号。推测LCDV通过与鳃、表皮及消化道上皮的受体结合进入牙鲆体内,通过与外周血白细胞上的受体结合侵染白细胞而进入血液循环,进而感染肝脏、脾脏、头肾等器官。

摘要:哈维群弧菌是弧菌属的核心菌群,包括溶藻弧菌在内的6个种在表型和遗传型上均十分相似,要准确鉴定各种有一定难度。看家基因的研究及生化鉴定系统的出现为弧菌鉴定提供了多种方法,本文比较了16S rRNA 基因、toxR基因和pyrH基因以及VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡对溶藻弧菌相关分离株的分辨力。哈维群弧菌基因组内16S rRNA基因是多拷贝的,且拷贝间序列差异大于种间差异,不适用于种的鉴定。单拷贝基因toxR和pyrH序列种内差异均小于种间差异。基于toxR基因相似性比较可清楚地将18个疑似溶藻弧菌分离株和5个参比株归并到4个种;toxR基因系统发育学分析也显示,哈维群弧菌各种独立地聚类分支,且溶藻弧菌种内存在两个明显的聚类分支,说明两个分支的溶藻弧菌具有独立的进化方向。pyrH基因的相似性比较和发育学分析也得到类似的结果,但pyrH基因具有较强的保守性,因而分辨力稍低于toxR基因。VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡在鉴定溶藻弧菌时也有一定的错误率,且鉴定谱较窄。因此,建议在实际应用中采用toxR基因比对作为溶藻弧菌快速鉴定的主要手段,可再选用pyrH基因对鉴定结果进行验证。

摘要:2009年10月江苏赣榆地区某养殖场养殖的三疣梭子蟹出现大量死亡,症状主要表现为:病蟹行动缓慢、不摄食,蟹体消瘦,打开头胸甲可见肝胰腺、鳃、肌肉等内脏组织水肿,部分肝胰腺和肌肉组织呈腐烂状。从患病梭子蟹肌肉、肝胰脏、体内积液中分离到大量优势生长的细菌。人工感染试验,证明分离菌(JG091120-1)对健康三疣梭子蟹具有很强的致病性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等常规表型生物学检验,同时利用分子生物学方法测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,其中分离菌16S rRNA基因序列长度为1 451 bp(登录号HQ170626),gyrB基因序列长度为1 186 bp(登录号HQ170627),分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性。根据分离菌的表型及分子生物学特性,判定该菌为肠杆菌科枸橼酸属的弗氏柠檬酸杆菌。定居因子抗原cfa是肠杆菌科产肠毒素细菌的一种重要致病因子,利用特异性引物进行cfa基因的PCR扩增,分离菌可以扩增出大小在100 bp的基因片段,表明本次分离的病原弗氏柠檬酸杆菌具有cfa毒力因子。

摘要:从广东省以及海南省等地区养殖的患病罗非鱼体内分离、收集到多株致病菌,经生化分析和分子生物学鉴定,均为无乳链球菌。对这些菌株分别进行了耐药谱测定、分子分型试验以及分子血清型分析。药敏试验结果表明,2007—2010年分离到的无乳链球菌耐药谱基本相似;多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)试验中,选择5个高变异指数的可变数目重复位点(VNTR)进行分子分型,结果表明,所有鱼源无乳链球菌菌株为同一MLVA型,而作为对照的牛源无乳链球菌则明显不同;为了对这些菌株进一步分型,分别进行了分子血清型和表面蛋白抗原基因的检测,结果表明,鱼源无乳链球菌的分子血清型均为Ⅰa型,表面蛋白抗原均为alpha-C蛋白。这进一步说明了不同年份和不同地区的鱼源无乳链球菌在基因水平上为同一分子类型,具有相同的起源或传染源。同时也说明,我国南方地区罗非鱼无乳链球菌在这几年中未发生明显的遗传变异。这些结果为罗非鱼无乳链球菌病疫苗研制,疫病监测及药物防治的研究提供理论依据。